25-羥基維生素D（25-OH-VD）
該系列產(chǎn)品已獲得發(fā)明專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)為ZL202311497182.3。
產(chǎn)品參數(shù)
| 名稱(chēng) | 25-羥基維生素D抗體（25-OH-VD antibody） | |
| 貨號(hào) | R483k3 | R484j4 |
| 類(lèi)型 | 單克隆抗體 | |
| 宿主 | 兔 | |
| 反應(yīng)物種 | 人 | |
| 應(yīng)用平臺(tái) 推薦配對(duì) |
化學(xué)發(fā)光 | 免疫層析 |
| R484j4（捕獲）-R483k3（檢測(cè)） | R483k3（捕獲）-R484j4（檢測(cè)） | |
| 純度 | Protein A/G純化，純度>95% | |
| 緩沖液 | 1xPBS，pH 7.4 | |
| 儲(chǔ)存 | -20℃或更低溫度，分裝保存，避免反復(fù)凍融 | |
標(biāo)記抗體及抗體偶聯(lián)磁珠
| 名稱(chēng) | 貨號(hào) | 標(biāo)記/偶聯(lián) | 推薦配對(duì) | 推薦平臺(tái) |
| 25-羥基維生素D夾心法 （25-OH-VD）標(biāo)記抗體 |
L216u1 | AE | L217u1（捕獲） L216u1（檢測(cè)） |
化學(xué)發(fā)光（AE） |
| L217u1 | Biotin | |||
| 25-羥基維生素D夾心法 （25-OH-VD）抗體偶聯(lián)磁珠 |
B200t1 | 羧基（COOH） 修飾磁珠 |
B200t1（捕獲） L216u1（檢測(cè)） |
|
| B201t1 | 對(duì)甲苯磺?；═osyl） 修飾磁珠 |
B201t1（捕獲） L216u1（檢測(cè)） |
||
| B202t1 | 鏈霉親和素（SA） 修飾磁珠 |
B202t1（捕獲） L216u1（檢測(cè)） |
發(fā)光大包裝試劑
| 名稱(chēng) | 貨號(hào) | 推薦平臺(tái) | 方法學(xué) |
| 25-羥基維生素D（25-OH-VD）發(fā)光大包裝試劑 | Q80h1 | 化學(xué)發(fā)光（AE） | 夾心法 |
解離劑
| 名稱(chēng) | 貨號(hào) | 推薦平臺(tái) | 樣本稀釋比例 |
| 25-羥基維生素D（25-OH-VD）中性解離劑 | D10a1 | 化學(xué)發(fā)光（AE、ALP） | 10:50 |
產(chǎn)品數(shù)據(jù)
1.校準(zhǔn)曲線(xiàn)——化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)
用V2.0版、V3.0版25-OH-VD大包裝試劑（Q80h1）分別檢測(cè)濃度范圍為0-147.04ng/mL的25-OH-VD校準(zhǔn)品，升級(jí)后的信噪增益幅度顯著提升，尤其是低端。
| 校準(zhǔn)品 | 濃度 （ng/mL） |
Q80h1-V2.0版 ?RLU |
Q80h1-V3.0版 RLU |
| S1 | 0.00 | 254 | 988 |
| S2 | 0.53 | 7866 | 55199 |
| S3 | 2.45 | 48364 | 172199 |
| S4 | 8.97 | 137856 | 363852 |
| S5 | 27.55 | 835688 | 1358846 |
| S6 | 66.23 | 2596874 | 2864657 |
| S7 | 147.04 | 5986321 | 6336428 |
表1.VD校準(zhǔn)曲線(xiàn)數(shù)據(jù)
2.靈敏度——化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)
用V2.0版、V3.0版Q80h1分別對(duì)零濃度稀釋液重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算最低檢測(cè)限，結(jié)果顯示升級(jí)后的Q80h1低端檢測(cè)靈敏度顯著提升。
| 名稱(chēng) | 濃度 （ng/mL） |
RLU平均值 | 線(xiàn)性方程 |
| 校準(zhǔn)品S1 | 0 | 254 | y=14362x+254 |
| 校準(zhǔn)品S2 | 0.53 | 7866 | |
| 20次重復(fù)測(cè)定零濃度稀釋液RLU值 | |||
| 658 | 433 | 332 | 448 |
| 455 | 538 | 465 | 432 |
| 369 | 579 | 483 | 695 |
| 488 | 661 | 224 | 455 |
| 493 | 577 | 269 | 387 |
| RLU均值 | 472 | ||
| SD | 124.0 | ||
| 平均值+2SD | 720 | ||
| 最低檢測(cè)限（ng/mL） | 0.032 | ||
表2.最低檢測(cè)限（Q80h1-V2.0版）
| 名稱(chēng) | 濃度 （ng/mL） |
RLU平均值 | 線(xiàn)性方程 |
| 校準(zhǔn)品S1 | 0 | 988 | y=102285x+988 |
| 校準(zhǔn)品S2 | 0.53 | 55199 | |
| 20次重復(fù)測(cè)定零濃度稀釋液RLU值 | |||
| 1033 | 946 | 1103 | 894 |
| 1055 | 973 | 964 | 1022 |
| 1084 | 966 | 933 | 1036 |
| 1058 | 1024 | 964 | 1055 |
| 998 | 1138 | 1105 | 1094 |
| RLU均值 | 1022 | ||
| SD | 66.0 | ||
| 平均值+2SD | 1154 | ||
| 最低檢測(cè)限（ng/mL） | 0.002 | ||
表3.最低檢測(cè)限（Q80h1-V3.0版）
3.相關(guān)性——化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)
用V2.0版、V3.0版Q80h1分別檢測(cè)82例質(zhì)譜賦值樣本（濃度范圍7.69~57ng/mL），樣本符合率（R2）分別為0.951和0.9803，升級(jí)后樣本符合率顯著提升。
圖1.VD臨床對(duì)比分析（質(zhì)譜賦值-V2.0版）
圖2.VD臨床對(duì)比分析（質(zhì)譜賦值-V3.0版）
| 編號(hào) | 樣本濃度 （ng/mL） |
檢測(cè)濃度 （ng/mL） |
| 1 | 7.69 | 6.34 |
| 2 | 8.35 | 7.48 |
| 3 | 8.94 | 8.11 |
| ? | ? | ? |
| 81 | 49.08 | 51.31 |
| 82 | 57 | 55.94 |
表4.VD臨床對(duì)比分析數(shù)據(jù)（質(zhì)譜賦值-V2.0版）
| 編號(hào) | 樣本濃度 （ng/mL） |
檢測(cè)濃度 （ng/mL） |
| 1 | 7.69 | 7.68 |
| 2 | 8.35 | 7.66 |
| 3 | 8.94 | 8.47 |
| ? | ? | ? |
| 81 | 49.08 | 50.08 |
| 82 | 57 | 56.95 |
表5.VD臨床對(duì)比分析數(shù)據(jù)（質(zhì)譜賦值-V3.0版）
4.試劑37℃7天熱加速穩(wěn)定性——化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)
將V2.0版、V3.0版Q80h1放置在37℃條件下，分別在0、7天時(shí)，去檢測(cè)低值和高值質(zhì)控品。V2.0版試劑測(cè)得的低值質(zhì)控品濃度7天跌幅為8%，高值質(zhì)控品跌幅9.92%。V3.0版試劑測(cè)得的低值質(zhì)控品7天跌幅為3%，高值質(zhì)控品跌幅2.18%。升級(jí)后的Q80h1熱加速穩(wěn)定性大幅提升。
圖3.試劑37℃7天熱加速穩(wěn)定性（低值質(zhì)控）
圖4.試劑37℃7天熱加速穩(wěn)定性（高值質(zhì)控）
5.校準(zhǔn)品穩(wěn)定性——化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)
由于小分子不穩(wěn)定，市面上主流的VD檢測(cè)試劑配套校準(zhǔn)品多采用凍干技術(shù)儲(chǔ)存，通常凍干后復(fù)溶穩(wěn)定性無(wú)法保障，且成本高。歐凱V3.0版25-OH-VD大包裝試劑配備的是液體校準(zhǔn)品，無(wú)需凍干，且開(kāi)瓶穩(wěn)定（見(jiàn)圖5、6），機(jī)載友好；2-8℃至少可以保存1年。此外，校準(zhǔn)品37℃7天熱加速穩(wěn)定性也依然優(yōu)秀，低值跌幅為3.2%，高值跌幅為2.4%（未展示）。
圖5.低值校準(zhǔn)品28天開(kāi)瓶穩(wěn)定性
圖6.高值校準(zhǔn)品28天開(kāi)瓶穩(wěn)定性
為滿(mǎn)足客戶(hù)需求，打造高品質(zhì)試劑，結(jié)合市場(chǎng)調(diào)研和用戶(hù)反饋意見(jiàn)，南京歐凱生物對(duì)25-OH-VD發(fā)光大包裝試劑（Q80h1）的核心原料及試劑性能進(jìn)行了全方位的優(yōu)化。升級(jí)版Q80h1試劑檢測(cè)靈敏度與線(xiàn)性兼具；在降低非特異性背景噪音的同時(shí)，大幅提高信號(hào)強(qiáng)度。與初代試劑相比，整體信噪比提升約45倍。
1.超強(qiáng)信噪比
Q80h1采用新一代小分子夾心檢測(cè)技術(shù)，其檢測(cè)靈敏度和特異性都顯著優(yōu)于競(jìng)爭(zhēng)法，但在線(xiàn)性和背景噪音方面卻仍有優(yōu)化空間。為此，我們對(duì)Q80h1的核心原料進(jìn)行了升級(jí)，升級(jí)后的背景噪音有效降低，信號(hào)增益幅度更大，區(qū)分度也更高。低端信噪比提升了15倍，高端信噪比提升了近45倍。
| 校準(zhǔn)品 | 濃度 （ng/mL） |
RLU |
| S1 | 0.00 | 195 |
| S2 | 1.15 | 12217 |
| S3 | 3.44 | 26591 |
| S4 | 15.71 | 208683 |
| S5 | 31.91 | 842490 |
| S6 | 70.33 | 2731118 |
| S7 | 153.86 | 6567286 |
| S2/S1 | 62.65 | |
| S6/S1 | 14005.73 | |
表1.25-OH-VD信噪比（升級(jí)后）
| 校準(zhǔn)品 | 濃度 （ng/mL） |
RLU |
| S1 | 0.00 | 14776 |
| S2 | 0.22 | 19850 |
| S3 | 1.08 | 55912 |
| S4 | 10.27 | 534999 |
| S5 | 45.02 | 2464797 |
| S6 | 75.15 | 4585520 |
| S3/S1 | 3.78 | |
| S6/S1 | 310.34 | |
表2.25-OH-VD信噪比（升級(jí)前）
2. 比標(biāo)質(zhì)譜金標(biāo)準(zhǔn)
用Q80h1檢測(cè)106例質(zhì)譜賦值樣本（濃度范圍7.69~57ng/mL），樣本符合率（R2）可達(dá)0.9645。
| 編號(hào) | 質(zhì)譜檢測(cè)濃度 （ng/mL)） |
自測(cè)濃度 （ng/mL） |
| 1 | 7.69 | 6.89 |
| 2 | 8.35 | 9.8 |
| 3 | 8.94 | 10.21 |
| ? | ? | ? |
| 105 | 49.08 | 54.77 |
| 106 | 57 | 54.38 |
表3.VD臨床對(duì)比分析數(shù)據(jù)（質(zhì)譜賦值）
圖1.VD臨床對(duì)比分析（質(zhì)譜賦值）
3. 檢測(cè)VD2高濃度樣本同樣精準(zhǔn)
臨床研究顯示：市售五大主流品牌（雅培、DiaSorin、IDS、羅氏、西門(mén)子）的25-OH-VD檢測(cè)試劑與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果臨床判定一致率不到71%。當(dāng)樣本中含有25-OH-VD2時(shí)，與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性更低。
為驗(yàn)證Q80h1對(duì)含有高濃度25-OH-VD2樣本的檢測(cè)能力，我們選取了11例25-OH-VD2含量明顯高于25-OH-VD3的VD質(zhì)譜賦值樣本。用Q80h1和一款市售主流競(jìng)爭(zhēng)法VD試劑同時(shí)對(duì)這些樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：Q80h1的檢測(cè)結(jié)果與質(zhì)譜符合率依然很高（R2=0.939），而競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)結(jié)果與Q80h1、質(zhì)譜均存在明顯偏差。
表4.VD臨床對(duì)比分析數(shù)據(jù)（質(zhì)譜賦值VD2高濃度樣本）
化學(xué)發(fā)光平臺(tái)（AE）
1.總25-OH-VD識(shí)別能力
25-OH-VD抗體對(duì)25-OH-VD2的識(shí)別能力直接影響總25-OH-VD檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。經(jīng)驗(yàn)證歐凱25-OH-VD發(fā)光大包裝試劑（Q80h1）與25-OH-VD2、25-OH-VD3有很好的反應(yīng)性，可有效識(shí)別樣本中的總25-OH-VD。
| 濃度 （ng/mL） |
RLU | |
| 25-OH-VD2 | 25-OH-VD3 | |
| 0.00 | 201 | 213 |
| 5.03 | 33900 | 21043 |
| 15.16 | 228481 | 155393 |
| 35.43 | 951458 | 780271 |
| 70.12 | 2720547 | 2188499 |
| 150.73 | 6429867 | 5647803 |
表5.總25-OH-VD識(shí)別能力數(shù)據(jù)
圖2.總25-OH-VD識(shí)別能力
2.最低檢測(cè)限
用Q80h1對(duì)零濃度稀釋液重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算最低檢測(cè)限。
| 名稱(chēng) | 濃度（ng/mL） | RLU平均值 | 線(xiàn)性方程 |
| 校準(zhǔn)品S1 | 0.00 | 195 | y=10454x+195 |
| 校準(zhǔn)品S2 | 1.15 | 12217 | |
| 零濃度稀釋液20次重復(fù)測(cè)定RLU值 | |||
| 213 | 231 | 198 | 245 |
| 205 | 241 | 193 | 265 |
| 230 | 205 | 249 | 232 |
| 232 | 232 | 208 | 322 |
| 225 | 216 | 230 | 316 |
| RLU均值 | 234 | ||
| SD | 34.1 | ||
| 平均值+2SD | 303 | ||
| 最低檢測(cè)限（ng/mL） | 0.010 | ||
表6.VD發(fā)光大包裝試劑最低檢測(cè)限
3.線(xiàn)性
將濃度為148ng/mL的質(zhì)譜賦值高濃度樣本用樣本稀釋液稀釋為50%、20%、10%、5%和1%五個(gè)濃度。用Q80h1對(duì)高濃度樣本及五個(gè)稀釋樣本進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算相關(guān)性。
| 百分比 | 濃度（ng/mL） | RLU | 絕對(duì)偏差 | 相對(duì)偏差 |
| 100% | 148 | 6399087 | / | 0.60% |
| 50% | 71.3 | 2961553 | / | -3.10% |
| 20% | 30.9 | 754539 | / | 4.70% |
| 10% | 14.2 | 190843 | -0.62 | / |
| 5% | 8.30 | 60302 | 0.83 | / |
| 1% | 1.41 | 15120 | -0.18 | / |
| 相關(guān)性：0.99971 | ||||
表7.VD發(fā)光大包裝試劑線(xiàn)性
4.重復(fù)性
利用同一批Q80h1對(duì)濃度為10.26ng/mL和50.31ng/mL的質(zhì)譜賦值樣本各重復(fù)檢測(cè)10次，其測(cè)量濃度變異系數(shù)（CV）均小于3%。
| 低值樣本 | ||
| 測(cè)定值編號(hào) | RLU | 濃度（ng/mL） |
| 1 | 97500 | 10.32 |
| 2 | 96880 | 10.28 |
| 3 | 94734 | 10.14 |
| 4 | 97811 | 10.34 |
| 5 | 93522 | 10.06 |
| 6 | 94886 | 10.15 |
| 7 | 104663 | 10.77 |
| 8 | 97966 | 10.35 |
| 9 | 95344 | 10.18 |
| 10 | 107463 | 10.94 |
| 平均值 | / | 10.35 |
| 標(biāo)準(zhǔn)差 | / | 0.28 |
| CV | 2.7% | |
表8.VD發(fā)光大包裝試劑重復(fù)性（低值）
| 高值樣本 | ||
| 測(cè)定值編號(hào) | RLU | 濃度（ng/mL） |
| 1 | 1731067 | 50.24 |
| 2 | 1810231 | 51.83 |
| 3 | 1752956 | 50.68 |
| 4 | 1713169 | 49.88 |
| 5 | 1785816 | 51.34 |
| 6 | 1738030 | 50.38 |
| 7 | 1741512 | 50.45 |
| 8 | 1762412 | 50.87 |
| 9 | 1726412 | 50.14 |
| 10 | 1726094 | 50.31 |
| 平均值 | / | 50.61 |
| 標(biāo)準(zhǔn)差 | / | 0.592 |
| CV | 1.17% | |
表9.VD發(fā)光大包裝試劑重復(fù)性（高值）
5.準(zhǔn)確度
將濃度為50.31ng/mL的質(zhì)譜賦值高濃度樣本，按照1：9的體積比加入到濃度為10.15ng/mL的低濃度血清中，配制成濃度為14.17ng/mL的混合物，用Q80h1進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率。
| 待測(cè)物 | 測(cè)定濃度（ng/mL） | RLU | 濃度平均值 （ng/mL） |
| 高濃度樣本 | 50.35 | 1736538 | 50.42 |
| 50.22 | 1730072 | ||
| 50.68 | 1752956 | ||
| 低濃度血清 | 10.12 | 94430 | 10.22 |
| 10.21 | 95803 | ||
| 10.34 | 97811 | ||
| 混合物 | 14.16 | 170846 | 14.26 |
| 14.32 | 174539 | ||
| 14.29 | 173842 | ||
| 回收率 | 100.28% | ||
表10.VD發(fā)光大包裝試劑回收率
6.熱穩(wěn)定性
將Q80h1試劑組份分別放置于37℃培養(yǎng)箱和4℃冰箱中加速7天，分別測(cè)試高、低值樣本，比較其偏差。
| 低值樣本 | ||||
| 測(cè)定值 編號(hào) |
RLU | 濃度（ng/mL） | ||
| 4℃7天 | 37℃7天 | 4℃7天 | 37℃7天 | |
| 1 | 93071 | 84504 | 10.03 | 9.44 |
| 2 | 94886 | 85490 | 10.15 | 9.51 |
| 3 | 92921 | 85207 | 10.02 | 9.49 |
| 偏差 | / | -5.8% | ||
表11.VD發(fā)光大包裝試劑熱穩(wěn)定性（低值）
| 高值樣本 | ||||
| 測(cè)定值 編號(hào) |
RLU | 濃度（ng/mL） | ||
| 4℃7天 | 37℃7天 | 4℃7天 | 37℃7天 | |
| 1 | 1736040 | 1635741 | 50.34 | 48.32 |
| 2 | 1725100 | 1637724 | 50.12 | 48.36 |
| 3 | 1738527 | 1632272 | 50.39 | 48.25 |
| 偏差 | / | -4.1% | ||
表12.VD發(fā)光大包裝試劑熱穩(wěn)定性（高值）
試用申請(qǐng)
VD臨床診斷意義
維生素D（Vitamin D，VD）是人體健康、生長(zhǎng)和發(fā)育必不可少的物質(zhì)，其缺乏或過(guò)量與多種疾病密切相關(guān)，如骨骼肌肉疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、免疫性疾病、腎臟疾病、神經(jīng)精神疾病等。
維生素D是一種類(lèi)固醇激素, 通過(guò)調(diào)節(jié)腸道吸收和腎臟重吸收作用維持機(jī)體的鈣平衡。維生素D主要包括2種類(lèi)型：維生素D2（VD2）和維生素D3（VD3），VD2主要通過(guò)攝取食物獲得（約占VD總量的10%），VD3主要通過(guò)日光中的紫外線(xiàn)照射皮膚產(chǎn)生。體內(nèi)維生素D通過(guò)與白蛋白和VD結(jié)合蛋白結(jié)合后經(jīng)血液運(yùn)送至肝臟, 在肝臟分泌的25-羥化酶的參與下, 25號(hào)位羥化過(guò)程并形成25-（OH）-VD。在腎臟中, 25-（OH）-VD進(jìn)一步被1α -羥化酶轉(zhuǎn)化成具有生物活性的1, 25（OH）2VD3（1, 25-dihydroxyvitamin D3, 又稱(chēng)骨化三醇）。最后在DBP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的載運(yùn)下，經(jīng)血液到達(dá)小腸、骨等靶器官中與靶器官的核受體（VDRn）或膜受體（VDRm）結(jié)合，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。
25-（OH）-VD是機(jī)體維生素D的主要儲(chǔ)存形式, 占VD總量的95%以上。由于其半衰期長(zhǎng)（2 ~ 3周）, 并且不受血鈣和甲狀旁腺素水平的影響, 因此被公認(rèn)為是客觀(guān)評(píng)價(jià)體內(nèi)VD含量的最佳指標(biāo)。
| 體內(nèi)25羥基維生素D含量（ng/ml） | 臨床建議 |
|---|---|
| <10 | 嚴(yán)重缺乏 |
| 10-20 | 缺乏 |
| 20-30 | 不足 |
| 30-100 | 正常 |
參考文獻(xiàn)
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